ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 PDF

ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 pdf czytaj online lub pobierz na swoje urządzenie. Dokument został dodany przez użytkownika.
ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5



Jeśli jesteś autorem/wydawcą i uważasz, że ktoś wgrał ten dokument bez pozwolenia oraz łamie on prawa autorskie, napisz na adres [email protected] i powiadom nas o tym, a my usuniemy zakazany plik w 24h.

 

 

Pobierz PDF


 

ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 Ebook transkrypt - 20 pierwszych stron materiału:

 

Strona 1 Wykład 5 16.03 Cel: znalezienie klonu który zawiera transkrypt w dużych ilościach Peroksydaza nie jest substratem, to białko. Zatem jak • Wybrano przypadkowy klon, wyizolowano DNA. połączyć to białko z DNA? – Poprzez reakcję siecio- • Po wycięciu insertu otrzymano sondę, którą wy- wania aldehydem glutarowym. W ten sposób powstaje korzystano do przeszukiwania biblioteki klonów. sonda, zaznakowana peroksydazą, która specyficznie Wynik: Sonda została związana specyficznie tylko w wiąże się z DNA klonu. jednym miejscu, tam skąd pobrano DNA. Trafiono na Jak przeprowadzić detekcję? Jak wykryć te miejsca, w klon, który nie jest nadreprezentowany. Ścieżka ślepa. których peroksydaza jest zlokalizowana? Wykorzystuje się zjawisko chemiluminescencji. Próba B: Wybrano kolejny przypadkowy klon. Od- Polega ona na tym, iż podczas reakcji chemicznej emi- tworzono procesy. towana jest energia w postaci świetlnej. Substratem dla Wynik: Po hybrydyzacji pojawia się wiele klonów. peroksydazy jest luminol. Oznacza to, że trafiono na klon, który jest obecny w Przykłady technik hybrydyzacyjnych do poszuki- wielu klonach innych. Mamy do czynienia z nadrepre- wania klonów zentowanym DNA. • znalezienie klonu, gdy nie dysponujemy informa- cją DNA ani RNA, ale posiadamy produkt białkowy. Peroksydaza chrzanowa Dla danego produktu białkowego można odtworzyć Jednoniciowa sonda DNA + glutaraldehyd DNA, znając układ aminokwasów • najlepiej wybrać taką sekwencję aminokwasową, HP której będzie odpowiadało najmniej kodonów. (np. Met HP – 1 kodon, Trp – 1 kodon) HP Sonda musi być jak najbardziej zdegenerowana, tak HP by zawierała jak najmniej różnych sekwencji. Hybrydyzacja HP HP Sonda jest znakowana przy pomocy kinazy P4. Na- stępuje przeszukanie biblioteki – Ale czy jest to wiąza- nie specyficzne? Dodanie luminolu Chemiluminescencja HP HP Hybrydyzacja kolonii • Poszukiwanie cDNA klonu, który reprezentuje transkrypt, występujący w komórkach w dużym nad- miarze. Transkrypt występuje w specjalnym klonie, który jest nadreprezetowany. Np. komórki produkujące insulinę lub gliadyna ... Biblioteka klonów Otrzymujemy trzy klasy (dwa sygnały słabe, trzeci A mocny). Trzeci może być specyficzny. Zatem wrócono B do sekwencji białka; odnaleziono inną, również zde- generowaną. Powtórzono doświadczenie z inną sondą. Jeśli wynik znów pokaże ten sam klon, duża szansa, że Hybrydyzacja klon zawiera szukaną przez nas sekwencję. Sonda A kolonii Sonda B • W różnych gatunkach wykorzystywane są różne kodony. Istnieją tablice podające informacje na ten te- mat. Dzeki temu można lepiej przewidywać sekwencje nukleotydów. • Hybrydyzacja heterologiczna pomędzy gatun- kami polega na tym, iż tą samą sondąprzeszukujemy biblioteki klonów innych gatunków, by uzyskać infor- macje, jak podobne są poszczególne geny względem Sonda A Sonda B siebie. Strona 2 • Hybrydyzacja heterologiczna w obrębie gatun- Immunoscreening ku ma na celu zbadanie podobieństw w obrębie rodzin Przeszukiwanie za pomocą przeciwciał: tych samych białek. Szukamy ostatniej sytuacji... Immunoscreening Kolonie Mamy sondę, która tylko częsciowo hybrydyzuje z sekwencją docelową. Podobieństwo białek należących Membrana do rodziny nigdy nie jest 100%. Liza komórek (chloroform) Te same aminokwasy – DNA może się różnić. Do- świadczenia te doprowadziły do wielu odkryć rodzin, np. kinaz, białek homeotycznych. 125 I • przypadek w którym nie dysponujemy informa- cją na temat sekwencji DNA, czy białek. W tym celu musimy dysponować przeciwciałami do określonych białek oraz biblioteką ekspresyjną, tzn. taką, w której klony podlegają ekspresji. W jaki sposób otrzymujemy bibliotekę ekspresyjną? Potrzebujemy wektory, które posiadają promotor aktywny w komórce bakteryjnej. Pod jego kontrolą Białko A – zaznakowane izotopem jodu, pochodze- znajdują się inserty. Otrzymuje się cDNA. Następnie nie bakteryjne, bardzo silnie wiąże immunoglobuliny. biblioteka ta jest ligowana z wektorem ekspresyjnym. Oczywiście mamy przeróżne fragmenty DNA, ale nie- Charakterystyka fagemidu pBlueScript SK (+) które cDNA pod kontrolą promotora bakteryjnego ule- Fagemid – wektor, który zawiera fragmenty gają ekspresji takiej, że dają produkt polipeptydowy. i faga i plazmidu. Istotą znalezienia sekwencji kodującej jest odnalezie- Fagemidy pBluescript II SK (+/–) nie klonu, w którym ta ekspresja zachodzi f1 (-) ori f1 (+) ori AAAAA TTTTT Dwuniciowe DNA ampicylina lacZ' ends, ligate Kpn I Ligacja do wektora pBluescript II SK (+/-) MCS cDNA Sac I 3.0 kb P lac Transformacja klony cDNA pUC ori ampicilin – cecha nadająca oporność na ampicilinę ori – miejsce z wektora pUC klon gliadynowy P lac – promotor, który jest pochodną promotora z operonu laktozowego (promotor aktywny w komórce bakteryjnej) lac Z’ – zatem może służyć do selekcji biało niebieskiej Jedyna różnica między biblioteką eksresyjną, a zwy- MCS – sekwencja wielokrotnego klonowania (za- kłą jest taka, że wektor zawiera promotor. wiera również promotory polimerazy T2 i T3). Strona 3 SacI, Kpn1 – miejsca restrykcyjne Możliwe jest hybyrydyzowanie ze sobą cząsteczek f1(+) ori – fragment z faga f1 (działanie: możemy pierwonych matrycy, ale preferowane jest hybrydyzo- cały czas używać fagemidu jako zwykłego wektora, wanie ze starterem. Startery są zawsze w nadmiarze, są a po zakażeniu komórki będzie wykorzystywana se- to krótsze fragmenty, ddlatego są one preferowane. kwencja f1(+) ori i od tej sekwencji zachodzić będzie 3 cykl: Hybrydyzująze sobą produkty cyklu drugie- replikacja, która zakończy kolistą cząsteczkę DNA jed- go, które mają już określoną długość (w ten sposób ną z nici wektora). określana jest ostateczna długość produktów PCR). Wersja (-) przy odwróconej sekwencji f1(+) ori. Zwykle produkty PCR analizujemy przy pomocy Funkcje: elektroforezy żelowej. • klonowanie fragmentów DNA Co wpływa na powodzenie eksperymentu? • separacja molekularna • zwielokrotnienie ilości Przede wszystkim odpowiednie zaprojektowanie • otrzymanie w postaci pojedynczej nici starterów. • wprowadzenie nadekspresji białka Startery są projektowane w oparciu o znaną już se- • selekcja biało-niebieska kwencę, okalają odcinek DNA, który ma być powie- • otrzymanie transkryptów in-vitro lany. Starter przedni – sekwencja nici górnej. Reakcja pCR Starter tylni – sekwencja nici dolnej. Starter musi być specyficzny! Co to znaczy? Reakcja syntezy DNA. Cechą szczególną jest to, że W całym genomie starter powinien parować tylko z syteza (w bardzo szczególnych warunkach) jest powta- jedną komplementarą sekwencją! Taki wynik jest uzy- rzana wielokrotnie. Następuje amplifikacja sekwencji skiwany za pomocą: DNA. • odpowiedniej długości startera (szacuje się, że Przed wynalezieniem metody PCR jedynym sposo- dla startera o długości 17 pz można znaleźć sekwencję, bem otrzymania DNA było klonowanie (wbudowanie która się powtórzy tylko raz) insertu do wektora i podział komórki). • konkretne temperatury Do reakcji PCR potrzebujemy: • startery Typowy profil temperaturowy • matrycę DNA • polimerazę 100 Denaturacja (1 min) Opis reakcji 90 • Matryca jest denaturowana. Otrzymujemy dwie nici, do których są hydrolizowane startery. Starte- 80 ry określają produkt, jaki będzie po reakcji (Długość Temperatura °C DNA) W PCR matrycą jest pojedyncza cząsteczka (nić) 70 (2 min) DNA dostarczana przez denaturację cząsteczki DNA (w komórce nić dostarczona przy udziale białek, m.in. 60 helikaz). Próbka jest następnie ochłądzana (temperatura znacznie niższa niż przy denaturacji). Wartość tempe- 50 ratury jest określana przez charakter starterów, które łączą się z obiema niciami. 40 • Synteza prowadzona przez termostabilną polime- 0 1 2 3 4 5 6 7 Czas (minuty) razę DNA na obu niciach. Temperatura powyżej 70°C (około 74°C) Należy zwrócić uwagę na temperaturę wiązania Krytycznym etapem dla osiągnięcia specyficzności starterów jest etap hybrydyzacji. 3 sytuacje hipotetyczne Skąd bierze sę amplifikacja? • Ekstremalne wartości pH wpływają na denatura- cję DNA Z powtarzalności cylki (głównie od cyklu 3) mamy • Wysoka temperatura powoduje rozerwanie wią- już matrycę o zdefiniowanej długości. zań wodorowych i dysocjację DNA. Zatem przy zbyt 1 cykl: Produkty, które są syntezowane mają dłu- wysokiej temperaturze startery nie hybrydyzują. gość określoną przez czas syntezy. • Temperatura jest za niska – starter hybrydyzuje 2 cykl: Mamy nić matrycową i produkt 1, znów na- tylko prezz niektóre reszty. Są to słabe oddziaływania. stępuje hybrydyzacja. Powstaą produkty, które maą już Zależy nam, aby wszystkie reszty hybrydyzowały. określoną długość. Strona 4 Temperatura topnienia DNA – temperatura, w któ- rej połowa cząsteczek DNA jest rozdysocjowana (po- łowowa cząsteczek związana lub nie) Jak to oszacować? T m = (4 × [G + C ] ) + (2 × [A + T ] )°C prawdziwe dla względnie krótkich długości DNA Temperatura hybrydyzuje – o 1-2°C niższa od tem- peratury topnienia → konieczność wykorzystania poli- meraz termostabilnych. Proces należy powtarzać około trzydzieści razy (teoretycznie powinno się uzyskać 2n-2 cząsteczek). Produktu może być trochę mniej, ponieważ polime- raz traci swoją aktywność podczas wzrostu tempera- tury oraz substraty ulegają rozkładowi częściowemu. mimo to ilość produktu DNA jest wystarczająca do dalszych badań.

 

To tylko tagi:
ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 pdf online
ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 książka w pdf
ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 pdf do pobrania
ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 ebook za darmo
ożyhar, inżynieria genetyczna, wykład 5 czytaj online

 

DOSTĘP 24/H

POBIERAJ EBOOKI O DOWOLNEJ PORZE
 

ZA DARMO

BEZ PŁATNOŚCI/ANKIET
 

UPLOAD

Dodaj własny dokument i pozwól pobierać go innym